Скобликов Н. Э. к.м.н., Забашта Н. Н. д.с.-х.н., Москаленко Е. А. к.т.н.

ГНУ СКНИИЖ, Россельхозакадемии, Российская Федерация, г.Краснодар

Зимин А. А. к.б.н.

Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г. К. Скрябина (ИБФМ), г.Пущино, Московская обл., Россия

Skoblikov N.E., Cand. Sci. Med., Zabashta N.N., Dr. Sci. Agr., Moskalenko E.A., Cand. Sci. Techn. 

State Scientific Institution, North-Caucasus Research Institute of Animal Husbandry under Russian Academy of Agricultural Sciences, Russian Federation, Krasnodar

Zimin A.A., Cand. Sci. Biol.

Skryabin’s Institute of Biochemistry and Physiology of Microorganisms, Pushchino, Moscow region, Russian Federation

Аннотация: охарактеризованы изоляты E.coli, выделенные от поросят, принимавших экспериментальный препарат сконструированный из нетрансдуцирующих колифагов. Несмотря на схожесть биохимических фенотипов, изоляты значительно отличаются резистотипом и плазмидным профилем.

Ключевые слова: свиньи; кишечный микробиоценоз; E. coli; колифаги.

Исследование выполнено при финансовой поддержке РФФИ в рамках научных проектов № 11-04-96575-р_юг_ц; 12-04-90864-мол_рф_нр и 13-04-00991-a.

Summary: E.coli strains isolated from intestinal microflora of piglets, treated with experimental non-transducing coliphage preparation, have been characterized. The isolates considerably differ by resistotypes and plasmid profile despite similarity of biochemical phenotypes.

Key words: pigs; intestinal microbiocenosis; E.coli; coliphages

The reported study was partially supported by RFBR, research projects No. 11-04-96575; 12-04-90864; 13-04-00991.

В отличие от патогенной E.coli [1], публикаций о составе комменсальной (непатогенной) кишечной палочки микробиоты у свиней значительно меньше [2]. Ещё меньше работ, посвящённых анализу качественного состава комменсальной E.coli при применении колифаговых препаратов, успешно применяющихся в свиноводстве и демонстрирующих специфичный антагонизм в отношении патогенной E.coli – возбудителя колибактериоза (эшерихиоза) [3].

В предыдущих работах нашего коллектива была детально изучена возрастная динамика коли-титра кишечника поросят первых 2-х месяцев жизни, а также охарактеризован спектр выделяемых изолятов E.coli [4]. Однако, нам представлялось важным дать характеризацию изолятов E.coli при приёме разработанного нами экспериментального фагового препарата, предназначенного для профилактики колибактериоза [5], выявив, таким образом, влияние приёма фагового препарата на смену спектра кишечных колиформ.

Целью работы было характеризация и установление фенотипических отличий изолятов E.coli, выделенных из кишечной микрофлоры поросят первых двух месяцев жизни как при содержании на основном рационе, так и при применении экспериментального колифагового препарата, предназначенного для профилактики кишечного колибактериоза.

Методика. Исследовано содержимое кишечного микробиоценоза двух групп  животных, каждая из которых представляла собой гнездо с поросятами (от 8 до 10 поросят), содержавшимися в одинаковых условиях на одинаковом рационе. Поросята второй группы получали экспериментальный фаговый препарат, представлявший собой микстуру из пяти колифагов T4-типа семейства Myoviridae [5]. В проведённых ранее опытах было установлено, что оптимальной схемой применения фаговых препаратов являлось их трёхкратное (с интервалом в три дня) применение в дозировке 1,0×10⁹ БОЕ на голову животным 28-дневного возраста [6].

У всех животных отбирались образцы содержимого толстой кишки в различном возрасте: на 17-й, 21-й, 24-й, 27-й, 31-й, 35-й, 39-й, 42-й, 46-й, 53-й, 59-й, 66-й день жизни (всего 12 раз). Из отобранных образцов делали серию 10-кратных разведений и осуществляли первичный посев биоматериала на среду Эндо с последующим инкубированием при 37°С в течение 24 ч. После инкубирования отбирали изолированные колонии, подозрительные на E.coli, учитывая их морфологические особенности.

Физиолого-биохимическую идентификацию выделенных изолятов проводили, оценивая их метаболическую активность  по 24 биохимическим тестам. Структурно-биохимическую идентификацию каждого изолята энтеробактерий проводили определением получаемого методом газовой хроматографии.

Спектр антибиотикорезистентности изолятов E. coli определяли диско-диффузионным методом к набору из 24 антимикробных химиотерапевтических препаратов.

Плазмидный профиль выделенных изолятов исследовали, используя щелочной метод выделения плазмидной ДНК с небольшими модификациями.

Результаты исследований и обсуждение. В результате анализа посевов биоматериала, отбираемого от шести животных за двенадцать возрастных периодов, выделено 40 изолятов E.coli от поросят I группы (14, 16 и 10 от одного животного за весь период наблюдения) и 30 изолятов E.coli (12, 10 и 8) от поросят II группы.

Физиолого-биохимические и структурно-биохимические различия между изолятоами были незначительны.

Все выделенные в обеих группах изоляты демонстрировали резистентность к тетрациклинам и чувствительность к фторхинолонам, аминогликозидам, карбапенемам, цефалоспоринам II и III поколения. Наибольшее разнообразие антибиотикорезистентности у наблюдалось в отношении пяти антибиотиков: ампициллина; нитрофурантоина; хлорамфеникола; цефаклора и цефуроксима.

При этом доля изолятов E.coli, чувствительных ко всем пяти указанным антибиотикам («полисенситивных») в I группе составила 42,5 %, во II группе – 83,3 %.

Было установлено, что штаммы E.coli различались количеством плазмид. Плазмиды обнаружились не у всех штаммов: Среди изолятов I группы безплазмидные штаммы составили 50,0 %, II группы – 33,3 %.

Из 20 типов дифференцируемых по молекулярной массе плазмид наиболее частыми типами являлись плазмиды с М.м. 10000 п.о. (обнаруживалась у 23,5 % изолятов) и с М.м. 45000 п.о. (обнаруживалась у 21,2 % изолятов).

Сопоставляя данные антибиотикорезистентности и плазмидного профиля конкретных штаммов, выяснилось, что изоляты, характеризующиеся одинаковыми резистотипами и выделяемые от одного и того же животного в разные временные промежутки,  не являются одними и теми же изолятами, персистирующими в кишечнике животного.

Спектр антибиотикорезистентности выделенных изолятов E.coli у поросят первых 3-9 недель жизни не коррелирует с плазмидным профилем данных изолятов; скорее всего, в развитии антибиотикорезистентности играют роль механизмы, обусловленные хромосомными генетическими детерминантами.

Список литературы

1. Nagy, B., Fekete, P. Z. (2005). Enterotoxigenic Escherichia coli in veterinary medicine. Int J Med Microbiol 295, 443–454.

2. Schierack P., Walk N., Reiter K., Weyrauch K.D. and Wieler L.H. Composition of intestinal Enterobacteriaceae populations of healthy domestic pigs. Microbiology 153 (2007), 3830-3837.

3. Smith HW, Huggins MB (1983) Effectiveness of phage treatment in experimental Escherichia coli diarrhoea in calves, piglets and lambs. J Gen Microbiol 129: 2659–2675.

4. Скобликов Н. Э., Забашта Н.Н., Москаленко Е. А., Зимин А. А. Возрастная динамика коли-титра кишечного микробиоценоза поросят в 3 – 9 недель жизни / Научные основы повышения продуктивности сельско-хозяйственных  животных. Сборник научных трудов СКНИИЖ. Ч.1 / СКНИИЖ - Краснодар, 2013. - С.15-18.

5. Скобликов Н. Э., Забашта Н.Н., Москаленко Е. А., Васильева Е.А., Зимин А. А. Применение нетрансдуцирующих бактериофагов для профилактики пост-отъёмной диареи поросят // Научные основы повышения продуктивности сельскохозяйственных животных. Сборник научных трудов. Ч.1 / СКНИИЖ ― Краснодар, 2010. ― С.137 ― 139.

6. Скобликов Н. Э., Кононенко С.И., Зимин А. А. Оптимальная схема применения нетрансдуцирующих бактериофагов E.coli для профилактики пост-отъёмной диареи поросят // Труды Кубанского Государственного аграрного университета. - 2012., № 4 (37), C.169-173.